高效液相色谱仪(HPLC)是分析实验室常用的测试仪器之一，其被广泛应用于研究开发、医药检验、食品检测、化工分析、环境监测等众多分析领域。此种仪器在使用过程中，难免会出现各种各样的问题，并将直接影响到所测数据的准确性和仪器的正常工作。操作者如果能了解故障的成因，清楚预防和排除这些故障的方法，正确使用并维护好仪器，就能最大限度地发挥仪器的性能。
一、流动相
首先流动相应选用色谱纯试剂、高纯水或双蒸水，酸碱液及缓冲液需经过滤后使用，过滤时注意区分水系膜和油系膜的使用范围；还有要注意水相流动相需经常更换（一般不超过2天），防止长菌变质；再就是在使用双泵时，A、B、C、D四相中，若所用流动相中有含盐流动相，则A、D（进液口位于混合器下方）放置含盐流动相，B、C（进液口位于混合器上方）放置不含盐流动相；A、B、C、D四个储液器中其中一个为棕色瓶，用于存放水相流动相。
二、试管
1、注意试管的洁净问题。
高效液相色谱分析法是一个很灵敏的分析方法，如果因使用不洁净的试管，便会影响试验结果的准确性。例如，在用甲醇作溶剂来溶解样品时，所用的小试管是用橡胶塞来做盖子的，因此，在每次进样时，都有一个保留时间固定的干扰峰存在，后经证实，此干扰峰是由甲醇浸泡橡胶塞而溶下的组分所产生，换用玻璃试管后，干扰峰消除。
2、塑料试管的溶解问题。
近年来，一次性塑料试管给试验人员带来了极大的方便，但是，在使用过程中一定要注意有机溶剂对试管的溶解现象，在利用此种试管提取样品时，有些有机溶剂(如lu仿等)对管壁有溶解现象，这些被溶解下来的物质有时也能在检测器上产生信号，从而干扰样品的测定。这时，可用相同的实验条件先行试验一下，看看不含被抽提物时，提取液在检测器上能否产生干扰信号，如确有干扰信号存在，就只能换用耐有机溶剂的玻璃试管了。
3、被测样品在试管壁上的吸附问题。
这个问题也应引起注意，否则也会影响测试结果的准确性，在治疗药物监测(Therapeutic Drug Monitoring,TDM)中，有些被测药物如阿米替林，丙咪嗪等易吸附在玻璃试管的管壁上，因此，操作中宜采用聚丙烯管，为防止提取中吸附现象的发生，可采用0.5%的已二胺已烷液做为提取剂，可有效地防止吸附。
三、样品：
1、 采用过滤或离心方法处理样品，确保样品中不含固体颗粒；
2、 用流动相或比流动相弱（若为反相柱，则极性比流动相大；若为正相柱，则极性比流动相小）的溶剂制备样品溶液，尽量用流动相制备样品液；
3、手动进样时，进样量尽量小，使用定量管定量时，进样体积应为定量管的3～5倍；
四、进样阀
目前，在分析型高效液相色谱仪中常用的进样阀是7725型进样阀，其内部的六通阀结构使进样操作非常方便，但是，如果使用不当，也会带来问题。例如，在高效液相色谱法的试验过程中，有时会有异常色谱峰的出现以及重现性不好的问题，这主要是由于操作方法不当所引起，要想解决此类问题，需从以下几个方面入手。
1、进样量的控制。用进样阀来进样时，阀内的样品环是定量的，(一般分析型进样阀的样品环体积为20ul)，由于进样时，注射到进样阀内的样品溶液在样品环的管路中有径向的速度梯度(即管轴处比管壁处的液流速度快)。因此，要想使样品环中充满样品溶液，从而使用进样阀来准确地定量，则必须使进样量大于样品环体积的2倍。如果用注射器来控制进样量，则最大只能注射样品环体积1/2的量，这样才能防止部分样品由溢流管溢出从而导致定量分析的误差。
2、进样阀的清洁问题。如果样品环中有上次进样时样品的残留，必然会污染下次注射进的样品，为防止这种现象的发生，应按下列步骤操作：a.进样阀有2个位置，INJECT和LOAD。首先在LOAD位置时，以注射器将流动相注入进样阀内清洗几次，每次用量大约40ul；b.然后将进样阀板手扳至INJECT位置时，再以流动相清洗几次，每次用量还是40ul；c.最后，再将样品注射到进样阀里。
按照上述的步骤操作，可以避免由进样阀引起的污染，从而使干扰峰消除并提高分析结果的准确性。
3、进样阀溢流管的堵塞。有时，进样阀的溢流管会发生堵塞现象，向进样阀内注射样品时，注射针推不动。此故障是由于溢流管的堵塞所致。堵塞的原因多半是由于溶解样品的流动相用的是盐溶液，而其中的盐在溢流管的排空端口处结晶所致。此时，可用小烧杯盛少量蒸馏水对溢流管口稍加浸泡，端口处盐的结晶就能被溶解掉，故障排除。如能在每次进样完成之后，用蒸馏水反复冲洗至溢流管中的盐分全部冲出，则可避免此故障的发生。
五、色谱柱：
1、 使用前仔细阅读色谱柱附带的说明书，注意适用范围，如pH值范围、流动相类型等；
2、 使用符合要求的流动相；
3、 使用保护柱；
4、 如所用流动相为含盐流动相，反相色谱柱使用后，先用水或低浓度甲醇水（如5％甲醇水溶液），再用甲醇冲洗。
5、 色谱柱在不使用时，应用甲醇冲洗，取下后紧密封闭两端保存；
6、 不要高压冲洗柱子；
7、 不要在高温下长时间使用硅胶键合相色谱柱。
六、流动相(MOBLLE PHASE)的问题
甲醇和乙腈在高效液相色谱分析法中常常被用来配制流动相。高效液相色谱法中常用的试剂最好是高等级的专用试剂，如色谱纯试剂。在要求不太严格时，优级纯甚至分析纯的试剂也能用。高效液相色谱分析法中常用的是紫外检测器，因此，从降低基线噪音和提高分析灵敏度上来考虑，应该使用紫外吸收小且杂质含量少的色谱纯试剂。
1、流动相的过滤。配制好的流动相在使用前一定要先用0.5um孔径的微孔滤膜来过滤。这是因为溶液中含有很多肉眼难以发现的微小颗粒，如果不把它们滤除掉，就会堵塞泵口、柱头上的过滤器，这样就堵塞了流动相的正常通道，使色谱柱的阻力增加，柱压升高，柱效下降。碰到这种情况时，要换用经过滤的流动相，并将堵塞的滤器拆下来浸泡在20%的硝酸水溶液中以超声波清洗机清洗20分钟，以除去滤片上的堵塞物。
2、流动相的脱气。流动相在使用前必须脱气，以尽可能的除去溶解在流动相中的气体，否则，这些气体会使柱填料的性能降低，还能够对检测器的信号产生很大的干扰。脱气有多种方法，如超声脱气、真空脱气、氮气脱气等。真空脱气法和氮气流脱气法是目前最常用的脱气法。水和甲醇混合后会产生大量的气泡，如果不脱气就使用，气泡就会进入色谱柱和检测器，并将影响分析工作的正常进行。
七、图谱
长期使用后的色谱柱，如果有杂质进入，就会使色谱柱入口处的固定相“板结”并在流动相所产生的高压作用下，形成柱头的塌陷，被分析的样品组分的正常色谱峰就变成了双峰，这时可按下述方法来修复色谱柱。首先将柱头的紧固螺母旋下，这时就会发现柱头内的固定相已被压缩进去了，严重时可缩进10mm以上。在这种情况下，我们可用针尖将流动相表层板结变黄的部分抠掉，并以相同的固定相将此塌陷区填平、压实，再将色谱柱的紧固螺丝上紧，修复工作即告结束。用经过修复后的色谱柱再做样品时，色谱峰就恢复正常了。
以上是呕心沥血的新高效液相色谱仪使用注意事项大全，从几个方面进行了详细讲解。希望大家看完能在日常工作中，对这些事项能够认真对待，做到有问题及时解决，以延长仪器的正常使用期限，发挥仪器性能的最大极限。
