一、范围
本标准规定了高效液相色谱仪主要性能的测试方法。
本标准适用于高效液相色谱仪(HPLC)、超高效液相色谱仪(UPLC)。
本标准测试方法分为单元部件和仪器整机两部分。
二、条件要求
3.1 仪器工作条件
环境温度：15℃~35℃；
相对湿度：20%~80%；
供电电源：电压 220 V±22V，频率 50 Hz±0.5 Hz，并接地良好；
室内避免易燃、易爆和强腐蚀性气体及强烈震动、电磁干扰，有良好的通风装置。
3.2 试验条件
试验用计量仪器、仪表和玻璃器皿等均按有关规定，经计量检定单位检定合格并满足量程和精度的要求；
标准溶液与试剂：标准溶液应使用满足相关标准的有证标准物质，并按照相关要求配制，各种试剂应使用优级纯或分析纯。
四、单元部件性能指标的测试
4.1 恒流泵
4.1.1 密封性
4.1.1.1 设备与试剂
高压截止阀一个，耐压不小于仪器压力上限 120%；精密压力表一个，量程不小于仪器压力上限的 120%，0.4 级；三通一个；秒表一块，分度值不大于 0.1 s。
纯水：二次蒸馏水，满足《GB/T 6682-2008 分析实验室用水规格和试验方法》中一级水要求，以下同。
4.1.1.2 测试方法
通过三通将恒流泵、高压截止阀和精密压力表连接，恒流泵最高压力设定为仪器压力上限90%处。以纯水为流动相，待系统排出气体，流量设置为 0.1 mL/min；运行仪器，将高压截止阀处于截流状态，压力将逐渐上升，达到仪器压力上限 90%时，停止运行；记录此时压力表示值 p1，保持 10min 后，记录压力示值 p2。按式(4-1)计算压力降。
4.1.2 流量准确度与精密度
4.1.2.1 设备与试剂
秒表一块，分度值不大于 0.1 s；带探针数字温度计一支，分度值不大于 0.1℃；分析天平一台，根据流量大小选择合适载荷，测试质量控制在天平载荷的 60%左右，准确度不低于 II级，实际分度值不大于 0.1 mg；背压装置一个，在设定流量下可提供(8±2)MPa 背压；合适规格的称量瓶三个。
纯水。
4.1.2.2 测试方法
连接恒流泵入口、出口管路，以纯水为流动相(将数字温度计探针插入流动相内，测定此时流动相的温度)，分别设定仪器流量上限的 1%、10%和 50%，调整背压在(8±2)MPa。待仪器运行稳定后，按照表 1 要求收集流动相，采用秒表计时，记录数据。分别按照式(4-2)、式(4-3)计算流量准确度和精密度。
注：流量的设定可根据恒流泵的流量范围而定，此处以流量上限为10 mL/min为例。
注：为方便起见，亦可采用检定合格的液体流量计(精度不低于0.01 mL/min)测试流量准确度与精密度。
4.1.3 压力脉动
4.1.3.1 设备与试剂
精密压力表一个，量程不小于仪器压力上限的 120%，0.4 级；背压装置一个：在设定 1.0 mL/min 流量下，在 0~30 MPa 范围内可调；秒表一块，分度值不大于 0.1 s。
纯水。
4.1.3.2 测试方法
依次连接恒流泵、精密压力表、背压装置入口与出口管路，以纯水为流动相，设定流量为仪器流量上限的 10%，调整背压为仪器压力上限的 20%左右(如仪器压力上限为 40 MPa，则背压调整在(8±2)MPa；如仪器压力上限为 100 MPa，则背压调整在(20±2)MPa)。待仪器运行稳定后，监测精密压力表示值，记录 10 min 内的最大、最小压力值及平均值(每间隔 1 min 读数一次，计算平均值)。按照式(4-4)计算压力脉动率δp。
4.2 自动进样器
4.2.1 进样准确度与精密度
4.2.1.1 设备与试剂
分析天平一台，准确度不低于 II 级，实际分度值不大于 0.1 mg；2 mL 样品瓶若干。
纯水。
4.2.1.2 测试方法
启动自动进样器，排除管路气泡，清洗进样针，取 2 mL 的进样瓶，加入一定量的纯水，用分析天平称量，记录数据。按表 2 执行取样，每次取样结束后，均对进样瓶进行称量，记录数据。按式(4-5)和式(4-6)进行计算 SS 和 SR，作为进样准确度与精密度*。
4.2.2 线性
4.2.2.1 设备与试剂
同 4.2.1.1。
4.2.2.2 测试方法
同 4.2.1.2，依次设定进样体积为 5uL，10uL，20uL，25uL，50uL(如样品环体积为 100 uL)，每个体积连续测量三次，记录数据，取算术平均值 m，与对应的取样体积作一元线性拟合校准曲线，得出线性相关系数 r。
4.2.3 残留
4.2.3.1 设备与试剂
高效液相色谱仪系统一套，C18 色谱柱一支(满足《GB/T 30433-2013 液相色谱仪测试用标准色谱柱》标准要求，理论塔板数不低于 18000，以下同)。
0.1 mg/mL 的萘/甲醇溶液；85%甲醇水溶液。
4.2.3.2 测试方法
将自动进样器连入测试用高效液相色谱仪系统中，采用 C18 色谱柱连接自动进样器出口与检测器入口，启动仪器，设置检测器波长为 254 nm，以 85%甲醇水溶液为流动相，流量设定为 1.0 mL/min，平衡系统。启动进样器，排除管路气泡，清洗进样针，取 2 mL 的进样瓶，加入一定量的 0.1 mg/mL 的萘/甲醇溶液，放入自动进样器托盘指定位置。设置自动进样器参数，进样前后各清洗 1 次(清洗体积为系统体积的 3~5 倍)，依次注入 20uL 的 0.1 mg/mL 的萘/甲醇溶液和 100%甲醇溶液。重复测量三次，记录色谱峰面积，取算术平均值，按式(4-7)计算残留量。
4.2.4 最小进样时间
在色谱数据工作站上设定分析方法，编辑序列，进样量设为 20uL，选择不洗针模式，点击运行序列，同时用秒表计时，至完成进样，色谱工作站开始采集数据为止，记录此过程的时间为最小进样时间。
4.3 色谱柱恒温箱
4.3.1 温度准确度与精密度
4.3.1.1 设备与试剂
校准过的带探针数字温度计一台，分度值不大于 0.1℃；空色谱柱管一支。
4.3.1.2 测试方法
将数字温度计探针放置在一支空色谱柱的中心，将空色谱柱固定在色谱柱温箱内放置色谱柱处，选择 4℃(制冷 1)、室温+10℃，40℃，温度上限的 90%进行测量。按温度从低到高顺序升温，开机加热或制冷 60 min 后，每隔 5 min 记录一次数字温度计显示温度 2，测试五次计算平均值。按照公式(4-8) 和( 4-9)计算温度准确度与精密度。
式中：
ts —温度设定值误差，作为温度准确度，℃；
—为5次测量的平均值，℃；
t0—温度设定值，单位为摄氏度（℃）；
tc —控温稳定性，作为温度精密度，℃；
tmax —x次测量最大值，℃；
tmin ——n次测量最小值，℃
注1：如色谱柱恒温箱具有制冷功能时，才需测试； 注2：亦可通过计算机软件实时检测温度变化曲线，待仪器稳定后，记录温度曲线，计算温度准确度与精密度。
4.4 检测器
4.4.1 通用性能指标
4.4.1.1 静态基线噪声与漂移
(1)设备与试剂
色谱数据工作站一套，纯水。
(2) 测试方法
按照表3要求，设定仪器参数，连接测试系统。开机预热60 min后，记录基线60 min；取60 min内平行包络线的中心线的起点与终点的差值作为检测器的基线漂移选取所记录基线中噪声较大的5 min作为计算噪声的基线，以1 min为界画平行包络线，按式(4-10)计算短期基线噪声。5个包络线宽度的平均值，作为检测器基线噪声。
4.4.1.2 信噪比
(1)设备与试剂
色谱数据工作站一套；二元梯度系统一套(梯度误差不大于±1%)或1 mL注射器一支；试剂：按照表4配制标准样品。
(2)测试方法
将检测器与二元梯度系统，以及色谱数据工作站连接好，按照表3设置仪器参数。开机预热后，以甲溶液为流动相A注入，1.0 mL/min的流量平衡系统，冲洗流通池至示值稳定后归零。然后以乙溶液为流动相B注入流通池，检测器示值稳定后记录响应信号值，重复测试三次，取算术平均值。然后按式(4-11)计算信噪比(S/N)，噪声计算方法参照4.4.1.1。
.................................... (4-11)
式中：
S/N—检测器信噪比；
H—检测器信号响应值；
N—基线噪声。
表4 不同类型液相色谱检测器信噪比、线
4.4.1.3 线性范围与灵敏度
(1)设备与试剂
色谱数据工作站一套；1 mL 注射器一支；试样：按照表 4 配制 1 个空白甲溶液，配制 10个系列浓度丙溶液。如紫外-可见检测器配制试样甲溶液：纯水；试样丙溶液：丙酮水溶液浓度依次为 0.1%、0.2%、0.3%、、1.0%。
(2)测试方法
将检测器和色谱数据工作站连接好，按照表3设置仪器参数。开机预热后，用注射器直接向检测池内注入表4甲溶液，冲洗检测池至示值稳定后将检测器回零。然后向检测池内依次注入表4乙溶液，充满检测池并使示值稳定，记录各浓度下的响应信号值，每个浓度重复测试三次，取算术平均值。以前五个浓度点和对应响应信号值作标准曲线，计算出后五点的理论响应值，与对应含量的响应信号值比较，响应信号值刚好大于计算值5%时，认为曲线弯曲，此点浓度作为线性上限CH。 CL值测定(信噪比推算法)： 以4.4.1.2测得结果线性推算信噪比为3时对应的浓度，即作为线性下限CL。
最后，由CH/CL算出检测器线性范围，CH值测定时标准曲线斜率作为检测器灵敏度。
4.4.2 紫外-可见检测器/二极管阵列检测器
4.4.2.1 波长准确度与精密度
(1)设备与试剂
色谱数据工作站一套，1mL注射器一支,氧化钬滤光片或0.4%氧化钬的10%高氯酸溶液：特征波长为242 nm，361 nm，536 nm。另外，亦可参照GB/T 26792-2011，采用0.0601 mg/mL重铬酸钾的0.05 mol/L硫酸溶液(紫外吸收波长标准溶液，特征波长为235 nm，257 nm，313 nm和350 nm)测试。
(2)测试方法
将检测器和色谱数据工作站连接好，开机预热稳定后，将氧化钬滤光片放置在流通池处或将0.4%氧化钬的10%高氯酸溶液注入流通池进行光谱扫描，重复测试三次，记录并保存，计算谱线波峰的波长示值与特征波长值之差。按照此法依次检验各个特征波长的示值误差，取其中最大值作为检测器波长准确度。计算重复三次中最大值与最小值之差作为检测器波长精密度。
4.4.3 示差折光检测器折光响应值准确度
4.4.3.1 设备与试剂
色谱数据工作站一套；1 mL 注射器一支或恒流泵一台；0.872 mg/mL 丙三醇水溶液（对应响应值为 1×10-4RIU）和 0.436 mg/L 丙三醇水溶液（对应响应值为 5×10-5RIU）.纯水。
4.4.3.2 测试方法
将检测器和色谱数据工作站连接好，开机预热，首先将纯水注入参比池和样品池，冲洗稳定后归零；然后将 0.436 mg/L 和 0.872 mg/L 丙三醇水溶液依次注入样品池，示值稳定后，记录响应值，重复三次取算术平均值，最后与标准值比较，计算 RIU 与 mV 的对应关系。
4.4.4 荧光检测器波长准确度与精密度
4.4.4.1 设备与试剂
色谱数据工作站一套，1 mL 注射器一支。
纯水，或者 1×10-4 mg/mL 萘甲醇溶液。
4.4.4.2 测试方法
将检测器和色谱数据工作站连接好，开机预热稳定后，向检测池内注入纯水，待检测器示数稳定后，分别设定纯水拉曼光谱的激发/发射特征波长为 350 nm/397 nm，进行激发和发射光谱扫描，重复测试三次，记录并保存光谱图。按照此法依次检验各个特征波长的示值误差，取其中最大值作为检测器波长准确度。计算重复三次中最大值与最小值之差作为检测器波长精密度。
另外，亦可采用1×10-4 mg/mL萘甲醇溶液测试，激发/发射特征波长为290 nm/330 nm。
五、仪器整机性能指标的测试
5.1 动态基线噪声与漂移
5.1.1 设备与试剂
色谱数据工作站一套，阻尼管或测试用 C18 色谱柱一支(理论塔板数不低于 18000)；
甲醇(色谱纯)或纯水。
5.1.2 测试方法
按照表 3 要求，设定仪器参数，连接测试系统。启动系统，以甲醇或纯水为流动相，流量为 1.0 mL/min(对 UHPLC，流量为 0.2 mL/min)，平衡稳定 60 min 后，记录基线 60 min。然后按照 4.4.1.1 方法，计算动态基线噪声与漂移。
5.2 梯度准确度与精密度
5.2.1 设备与试剂
色谱数据工作站一套，紫外-可见检测器一台，两通一个，背压装置(10±2)MPa 一套。丙酮(分析纯)，纯水；流动相：A，纯水；流动相 B，0.1%丙酮/水溶液。
5.2.2 测试方法
通过两通和背压装置将梯度系统与检测器相连，检测器波长设置为 254 nm；色谱数据工作站与梯度系统、检测器信号输出端连接，按图3设置梯度参数。恒流泵总流量设为1.0 mL/min，待仪器稳定后，开始采集数据，得到梯度曲线。测量各种溶液配比时的输出信号值，用公式(5-1)计算各种溶液配比时的梯度误差，取其中最大者为梯度准确度，重复三次，按照公式(5-2)计算梯度精密度。对于四元梯度系统采用同样的方法分别测定 AB、AC、CD 、BC、BD 五组台阶梯度，每组重复三次。
5.3 系统延迟体积
设备与试剂同5.2.1。
测试方法参照5.2.2，先以100%流动相A，0.2 mL/min平衡系统,基线稳定后，按照表5设置梯度程序，启动程序采集检测器信号，记录谱图并保存。然后在谱图上读取基线上扬拐点(50%响应信号处)对应的时间t(min)，按照公式(5-3)计算梯度系统延迟体积。
表5 系统延迟体积梯度设置表
5.4 密封性
参照4.1.3，测试点为压力上限90%，测试位置：(1)进样阀后，色谱柱前；(2)色谱柱后，检测池前。观察恒流泵压力降，滤纸检测是否有泄漏。
5.5 重复性
5.5.1 设备与试剂
色谱工作站一套,带 20uL 样品环(对于 UHPLC，选择 1uL 样品环)的手动进样阀一个(配自动进样器则不需要)，合适规格的注射器一支(配自动进样器则不需要)，C18 色谱柱一支(理论塔板数不低于 18000)或阻尼管；试样参见表 6;流动相为 85%甲醇水溶液(样品色谱峰保留因子 k 值不低于 3)或纯水。
5.5.2 测试方法
仪器整机系统(包括恒流泵、检测器、色谱柱、进样系统、色谱工作站等)连接好，按照仪器系统配置的检测器类型选择流动相等测试条件和参数，见表3和表6。 以85%甲醇水溶液为流动相，流量为1.0 mL/min，基线稳定后注入20 L相应的试样，记录保留时间和峰面积，连续7次。
注：对于UHPLC，色谱柱选择亚2um，2.1×50mm，流量设为0.2 mL/min，进样量为1uL。
分别将保留时间、峰面积测试数据代入式(5-4)计算定性、定量重复性RSD值。
.................. (5-4)
式中：
RSD—定性、定量重复性相对标准偏差；
Xi—第i 次测得的保留时间或峰面积；
—n 次测量结果的算术平均值；
i—测量序号；
n—测量次数(n＝7)。
5.6 检出限与定量限
设备与试剂同5.5.1，试样按照表6选择。
测试方法参照5.5.2，基线稳定后注入相应的试样，采集谱图，记录色谱图中试样的峰高和基线噪声，重复三次取平均值。然后按式(5-5)、(5-6)计算，作为仪器的检出限(S/N=3)与定量限(S/N=10)。
式中：
cLOD—检出限，mg/mL(以最小检出浓度计)； cLOQ—定量限，mg/mL(以最小定量浓度计)；
Ni—动态基线噪声，AU（或V）；
c—样品浓度，mg/mL； H—样品峰高，AU（或V）；
V—进样体积，μL；
注：式中的数字“20”为标准的进样体积，μL。
5.7 线性范围
设备与试剂同5.5.1，试样按照表6选择。
测试方法参照5.5.2，基线稳定后，由低到高，依次注入10个不同浓度相应的试样，采集谱图，每个浓度重复测试三次，取算术平均值。以前五个浓度点和对应峰面积作标准曲线，计算出后五点的理论峰面积，与对应含量的峰面积比较，峰面积刚好大于计算值5%时，认为曲线弯曲，此点浓度作为线性上限CH。 以5.6测得的检测限作为线性下限CL。最后，由CH/CL算出检测器线性范围。
表6 配置不同检测器时试样的选择
注：仍未达到线性拐点，则需加大或减小试样浓度后继续进行测。
